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食品微生物檢驗GB4789.5-2012 志賀氏菌檢驗及注意事項
發布時間：2020-11-18 瀏覽次數：12955 分享：
一、志賀氏菌的生物學特性
生物學特性：志賀氏菌屬細菌為革蘭氏陰性短桿菌，長約2～3μm，寬0.5～0.7μm，無芽胞，無莢膜，無鞭毛，有菌毛，不運動；需氧或兼性厭氧，對營養要求不高，在普通培養基（如營養瓊脂）上即能生長；最適生長溫度35~37℃，適宜pH為6.4~7.8。發酵糖類產酸不產氣(福氏和鮑氏志賀菌中的某些血清型偶可產生少量氣體)。分為4個群：A群（痢疾志賀氏菌）、B群（福氏志賀氏菌）、C群（鮑氏志賀氏菌）、D群（宋內氏志賀氏菌）。
流行學特征：志賀氏菌產生強烈的內毒素（endotoxin，ET），是一種脂多糖和脂蛋白復合物，為志賀氏菌致病的重要致病因素。A群志賀氏菌Ⅰ型能產生一種毒性極強的細菌外毒素稱為志賀毒素（Shigatoxin，Stx），與感染者中毒性腹瀉、出血性腸炎、溶血性尿毒癥等嚴重并發癥的發生密切相關，其毒性可表現為神經毒性、細胞毒性和腸毒性。在我國以福氏和宋內志賀菌引起的菌痢最為常見。 病人和帶菌者是細菌性痢疾的傳染源，由于飲食從業人員的帶菌，可以使食品污染而造成食物型爆發。由于污水滲入供水系統，也常造成水型的爆發。
二、志賀氏菌的檢驗
三、培養基原理解析
1. 志賀氏菌增菌肉湯培養基
?培養基中除胰蛋白胨、葡萄糖外，加入新生霉素作抑菌劑，并加入少量的吐溫80作增溶劑，以幫助樣品的充分分散。
?41℃厭氧培養有助于抑制其它雜菌生長。
2. 麥康凱瓊脂培養基（MAC）
?利用膽鹽來抑制革蘭氏陽性細菌的生長；利用乳糖發酵，中性紅的顏色可把分解乳糖和不分解乳糖的細菌區分開。
?志賀氏菌呈無色菌落，半透明，光滑，濕潤，圓形，邊緣整齊或不齊。
麥康凱瓊脂培養（MAC）
3.木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽（XLD）瓊脂培養基
?脫氧膽酸鈉可以抑制革蘭氏陽性細菌和部分大腸桿菌，多數志賀氏菌不能發酵木糖，木糖的添加可將志賀氏菌與其它菌株區別開來，因此，志賀氏菌在XLD平板上呈現無色菌落，但少數發酵木糖的志賀氏菌在此平板上會被漏檢，XLD平板對宋內志賀氏菌亦有輕度抑制作用。
?志賀氏菌通常呈粉紅色至無色，半透明，光滑，濕潤，圓形，邊緣整齊或不齊菌落。
木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽（XLD）瓊脂菌落特征
4.志賀氏菌顯色培養基
?利用非志賀氏菌的特異性的酶，使其與酶底物結合形成不同顏色的菌落，而生化特性反應不活躍的志賀氏菌經22~28h培養后，則形成易于識別的白色-粉紅色（與培養基顏色相近）的菌落。
?志賀氏菌呈白色/清晰的菌落，大小約為1～3mm，周圍培養基變紅。
5.三糖鐵瓊脂培養基
?該培養基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例為10:10:1，只能利用葡萄糖的細菌，葡萄糖被分解產酸使斜面先變黃，但因量少，生產的少量酸。因接觸空氣而氧化，加之細菌生長利用培養基中含氮物質，生成堿性產物，故斜面后來又變紅。底部由于厭氧狀態，酸類不被氧化，仍保持黃色。而發酵乳糖的細菌，則產生大量的酸，使整個培養基呈黃色。另外，因某些細菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氫，硫化氫和培養基中的鐵鹽反應生成黑色的硫化亞鐵沉淀。
三糖鐵
6.靛基質試驗
?某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。
?結果判讀：陽性為滴加靛基質試劑后液面立即變玫紅色； 陰性為滴加試劑后不變紅色。
靛基質試驗
7.尿素酶試驗
?具有尿素酶的細菌分解培養基中的尿素，產生大量的氨，使培養呈堿性，酚紅指示劑在pH6.8時呈黃色，pH8.1呈粉紅色。
?結果判讀：陽性為玫紅色； 陰性為淡橙紅色-淡黃色。
尿素酶試驗
8.賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶試驗
?具有氨基酸脫羧酶的細菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺（賴氨酸→尸胺）和二氧化碳，使培養基變堿，使指示劑顯示出來。
?結果判讀：陽性為試驗管為綠色-藍綠色，對照管變黃色； 陰性為試驗管和對照管均變黃色，或均不變色。
賴氨酸脫羧酶試驗陽性
9.糖（醇）發酵試驗
?絕大多數細菌都能利用糖（醇）類作為碳源和能源，但是它們在分解糖（醇）的能力上有很大的差異，有些細菌能分解某種糖（醇）并產酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫、甲烷、二氧化碳等）；有些細菌只產酸不產氣。酸的產生可利用指示劑來斷定。
?（指示劑為溴甲酚紫）結果判讀：陽性為變黃色； 陰性為紫色。
甘露醇發酵試驗
10.β-半乳糖苷酶
?某些細菌可產生b-半乳糖苷酶，能分解鄰硝基酚-b半乳糖苷（ONPG），生成黃色的鄰硝基酚。
?結果判讀：陽性為黃色； 陰性為不變色-淡黃色。
ONPG生化管
11. 葡萄糖銨試驗
?鑒別細菌利用銨鹽作為唯一氮源并分解葡萄糖的試驗。溴麝香草酚藍是指示劑，產酸時培養基由綠色變黃色。
?結果判讀：陽性為黃色； 陰性為綠色。
葡糖糖銨利用試驗
12. 西蒙氏檸檬酸鹽培養基
?細菌能利用檸檬酸鹽作為唯一的碳源，能在除檸檬酸鹽外不含其他碳源的培養基上生長，分解檸檬酸鹽生成碳酸鈉，使培養基變堿性。
?結果判讀：陽性為藍綠-藍色； 陰性為綠色。
西蒙氏檸檬酸鹽培養基試驗
13. 粘液酸鹽試驗
?某些細菌能利用粘液酸鹽，分解產酸，使培養基中的溴麝香草酚藍變黃色。
?結果判讀：陽性為黃色； 陰性為綠色-藍綠色。
粘液酸鹽試驗
四、志賀氏菌的生化鑒定
生化反應 | A群：痢疾志賀氏菌 | B群：福氏志賀氏菌 | C群：鮑氏志賀氏菌 | D群：宋內氏志賀氏菌 |
?-半乳糖苷酶 | －a | － | －a | ＋ |
尿素 | － | － | － | － |
賴氨酸脫羧酶 | － | － | － | － |
鳥氨酸脫羧酶 | － | － | －b | ＋ |
水楊苷 | － | － | － | － |
七葉苷 | － | － | － | － |
靛基質 | －/＋ | (＋) | －/＋ | － |
甘露醇 | － | ＋c | ＋ | ＋ |
棉子糖 | － | ＋ | － | ＋ |
甘油 | (＋) | － | (＋) | d |
注：+表示陽性；-表示陰性；-/+表示多數陰性；+/-表示多數陽性；（+）表示遲緩陽性；d表示有不同生化型。 | ||||
a痢疾志賀1型和鮑氏13型為陽性。 b鮑氏13型為鳥氨酸陽性。 c福氏4型和6型常見甘露醇陰性變種。 | ||||
?附加生化鑒定
?由于某些不活潑的大腸埃希氏菌（anaerogenic E.coil.）、A-D（堿性-異型Alkalescens-D isparbiotypes）菌的部分生化特征與志賀氏菌相似，并能與某種志賀氏菌分型血清發生凝集。需要進一步做葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(36℃培養24 h～48 h)。
生化反應 | A群：痢疾志賀氏菌 | B群：福氏志賀氏菌 | C群：鮑氏志賀氏菌 | D群：宋內氏志賀氏菌 | 大腸埃希氏菌 | A-D菌 |
| |||
葡萄糖銨 | － | － | － | － | ＋ | ＋ | ||||
西蒙氏檸檬酸鹽 | － | － | － | － | d | d | ||||
粘液酸鹽 | － | － | － | d | ＋ | d | ||||
注1：+表示陽性；-表示陰性；d表示有不同生化型。 注2：在葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗三項反應中志賀氏菌一般為陰性，而不活潑的大腸埃希氏菌、A-D（堿性-異型）菌至少有一項反應為陽性。 | ||||||||||
|
五、志賀氏菌的血清診斷
?志賀氏菌屬沒有動力，所以沒有鞭毛抗原。志賀氏菌屬主要有菌體（O）抗原。菌體O抗原又可分為型和群的特異性抗原。
?一般采用1.2%～1.5%瓊脂培養物作為玻片凝集試驗用的抗原
?在玻片上劃出2個約1cm×2cm的區域，挑取一環待測菌，各放1/2環于玻片上的每一區域上部，在其中一個區域下部加1滴抗血清，在另一區域下部加入1滴生理鹽水，作為對照。
?再用無菌的接種環或針分別將兩個區域內的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1 min，并對著黑色背景進行觀察，如果抗血清中出現凝結成塊的顆粒，而且生理鹽水中沒有發生自凝現象，那么凝集反應為陽性。
?如果待測菌的生化特征符合志賀氏菌屬生化特征，而其血清學試驗為陰性的話，可挑取菌苔于1mL生理鹽水做成濃菌液，100℃煮沸15 min～60 min去除K抗原后再檢查。
六、所需培養基試劑
用途 | 貨號 | 名稱 | 規格 |
增菌 | 023141 | 志賀氏菌增菌肉湯 | 瓶（干粉）250g |
SR0380 | 志賀氏菌增菌肉湯配套試劑（新生霉素） | 盒（西林瓶）10支/盒 | |
CP0730 | 志賀氏菌增菌肉湯（需加配套試劑） | 盒（袋裝）225 mL×10袋 | |
平板分離 | 029999 | 木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂（XLD） | 瓶（干粉）250g |
029999P1 | 木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂（XLD） | 瓶（顆粒）250g | |
CP0180 | 木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂（XLD） | 盒（平板）90 mm×20 | |
022144 | 麥康凱瓊脂 | 瓶（干粉）250g | |
024076 | 麥康凱瓊脂培養基平板 | 盒（平板）90 mm×20 | |
CRM011 | 志賀氏菌顯色培養基 | 1000mL | |
CRM011A | 志賀氏菌顯色瓊脂平板 | 盒（平板）90 mm×20 | |
生化鑒定 | 022080 | 三糖鐵瓊脂（TSI） | 瓶（干粉）250g |
CP0080 | 三糖鐵斜面 | 盒（管裝）20支 | |
026050 | 半固體瓊脂 | 瓶（干粉）250g | |
075350A | 半固體瓊脂 | 盒（管裝）20支 | |
CP0150 | 營養瓊脂 | 盒（管裝）20支 | |
024089 | 營養瓊脂平板 | 盒（平板）90 mm×20 | |
022020 | 營養瓊脂 | 瓶（干粉）250g | |
022020P1 | 營養瓊脂(NA) | 瓶（顆粒）250g | |
023090 | 尿素瓊脂培養基基礎 | 瓶（干粉）100g | |
029100 | 40%無菌尿素溶液 | 盒（西林瓶）10支/盒 | |
生化鑒定 | 075150 | 尿素（凍干） | 盒（西林瓶）10支/盒 |
075280 | 賴氨酸脫羧酶培養基 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075270 | L-鳥氨酸脫羧酶培養基 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075290 | 氨基酸脫羧酶對照培養基 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
029110 | 無菌石蠟油 | 10 mL×1支 | |
075180 | β-半乳糖苷ONPG | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075140 | 水楊素（水楊苷） | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075160 | 七葉靈（七葉苷） | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075040 | 甘露醇 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075230 | D-棉籽糖 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
生化鑒定 | 022110 | 蛋白胨水(靛基質培養基，色氨酸肉湯) | 瓶（干粉）100g |
075240 | 蛋白胨水(靛基質培養基，色氨酸肉湯) | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
029230 | 靛基質試劑 | 10 mL×1支 | |
075840 | 甘油發酵管 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075260 | 葡萄糖銨 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
023150 | 葡萄糖銨培養基 | 瓶（干粉）250g | |
075200 | 西蒙氏檸檬酸鹽 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
022120 | 西蒙氏檸檬酸鹽培養基 | 瓶（干粉）250g | |
075521 | 粘液酸鹽測試肉湯 | 盒（西林瓶）20支/盒 | |
075522 | 粘液酸鹽質控肉湯 | 盒（西林瓶）20支/盒 |
